Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации
Реферат.
Дипломная работа на тему: «Биохимические показатели крови человека
при сальмонеллезной интоксикации» содержит 46 страниц печатного текста,
таблиц, 8 рисунков, 59 использованных источников литературы, из них 10
иностранных.
Перечень ключевых слов: сальмонеллез, перекисное окисление липидов,
циркулирующие иммунные комплексы, каталаза, молекулы средней массы,
сывороточный альбумин, эндогенная интоксикация.
Объект исследования: сыворотка крови практически здоровых людей и
больных сальмонеллезом г. Пензы.
Практическое применение: в здравоохранении.
Список сокращений.
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы;
ЧСА – человеческий сывороточный альбумин;
МДА – малоновый диальдегид;
ПЭГ – полиэтиленгликоль;
АОС – антиокислительная способность;
АТ – антитело;
АГ – антиген;
ИК – иммунный комплекс;
ЛПС – липополисахаридный комплекс;
МСМ – молекулы средней массы;
ТБК – тиобарбитуровая кислота;
ЭКА – эффективная концентрация альбумина;
ОКА – общая концентрация альбумина;
ТХУ – трихлоруксусная кислота;
ЦНС – центральная нервная система;
ц-АМФ – циклический аденозинмонофосфат;
АФК – активные формы кислорода;
LOOH, HOOH – гидроперекиси;
СОД – супероксиддисмутаза.
Содержание.
|Введение……………………………………………………………….. |5-6 |
| | |
|Обзор литературы ………………………………………………... |7-19 |
|Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной | |
|инфекции…………………………..…….. |7-11 |
|Молекулярные механизмы развития эндогенной | |
|интоксикации при сальмонеллезе……………………..….. |11-14 |
|Показатели уровня эндогенной интоксикации | |
|организма при сальмонеллезе………………………………. |14-19 |
| | |
|Материалы и методы исследования…………………………. |20-25 |
|Материалы исследования……………………………………. |20 |
|Методы исследования………………………………………… |20-25 |
| | |
|Результаты и обсуждение………………………………….…… |26-34 |
|Определение показателей уровня интоксикации в | |
|сыворотке крови практически здоровых людей…….. |26-27 |
|Определение показателей уровня интоксикации в | |
|сыворотке крови больных сальмонеллезом………….….. |28-34 |
| | |
|Список использованных источников……………………….….. |35-40 |
| | |
|Выводы…………………………………………………………………. |41 |
| | |
|Приложения……………………………………………………………. |42-46 |
Введение
Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями в нашей стране
общепризнанны. Вместе с тем в инфектологии еще остаются проблемы, имеющие
серьезное социально-экономическое значение для всех стран мира. К их числу
относятся острые кишечные инфекционные заболевания [1].
Сальмонеллез – группа острых кишечных инфекционных болезней,
вызываемых бактериями рода Salmonella, характеризующихся значительным
полиморфизмом клинического течения, частым наличием интоксикации,
лихорадки, признаков поражения желудочно-кишечного тракта [2].
Крупные достижения отечественных и зарубежных исследователей,
установивших патогенетическое значение нарушения биологической регуляции
при острых кишечных инфекциях, дали новый импульс в изучении патогенеза
сальмонеллеза [3].
Иммунная система представляет собой сложную многокомпонентную систему
из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной к
воздействию токсинов бактерий. Это приводит к нарушению иммунорегуляторных
процессов.
Наиболее информативными являются показатели состояний прооксидантно-
антиоксидантного равновесия, которое при усилении действия на организм
токсинов смещается в сторону активизации ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, Ит,
МСМ.
ПОЛ – это фундаментальный универсальный молекулярный механизм,
лежащий в основе устойчивости и адаптационных возможностей организма. В
норме ПОЛ обеспечивает условие для жизненно важных функций клетки, в случае
же интоксикации становится пусковым механизмом патобиохимических изменений
в организме человека.
Целью моей дипломной работы является изучение биохимических
показателей эндотоксикоза в динамике патологического процесса. В задачи
исследования входило:
1. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и
активности каталазы в группе контроля, которую составили практически
здоровые люди.
2. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и
активности каталазы у больных сальмонеллезом.
3. Исследование изменения изучаемых показателей у больных в зависимости
от степени тяжести заболевания.
1. Обзор литературы
1. Биохимическая характеристика интоксикации при
сальмонеллезной инфекции
Сальмонеллезы принадлежат к числу инфекционных заболеваний, весьма
широко распространенных на всех континентах мира. Возбудителем
сальмонеллезов являются микроорганизмы, принадлежащие к роду Salmonella,
семейства кишечных Enterobacteriaceae.
Сальмонеллы – это мелкие бактерии вытянутой формы с
закругленными концами длиной от 1 до 3 и диаметром 0,5-0,8 нм [4].
Сальмонеллез встречается чаще у жителей городов, чем сел, что
связывается с лучшей регистрацией заболеваемости, наличием множественных
детских учреждений, широким употреблением пищевых полуфабрикатов.
Заболевание отмечается круглый год, но максимальное число регистрируется в
теплое время года, что объясняется благоприятными условиями размножения
сальмонелл в пищевых продуктах и реализации инфекции [5].
Таблица 1.1.1.
Статистические данные больных сальмонеллезом г. Пензы.
|Год |Количество |На 100 тыс. |Кол-во больных |На 100 тыс. |
| |больных |населения, % |Пензенской |населения, % |
| |г. Пензы | |области | |
|1996 |187 |34,9 |362 |23,1 |
|1997 |140 |26,1 |316 |20,3 |
|1998 |230 |43,0 |448 |28,8 |
В возникновении сальмонеллеза ведущую роль играют живые бактерии,
гибель которых в организме больного сопровождается развитием
эндотоксинемии. Принято выделять два вида токсичных продуктов
жизнедеятельности микробов-экзотоксии и эндотоксии. К экзотоксинам отнесены
токсичные продукты жизнедеятельности бактерий, активно (при жизни)
секретируемые в окружающую среду, а к эндотоксинам – те ядовитые для
макроорганизма продукты жизнедеятельности, которые освобождаются только при
лизисе микробной клетки [6].
Кроме токсина палочка имеет ряд антигенов клеточной стенки. О-антиген
расположен на поверхности микробной клетки и представляет собой
фосфолипидно-полисахаридный комплекс, включающий 60 % полисахарида, 20-30 %
липида и 3-4,5 % гексозамина. Н-антиген определяется жгутиками.
Поверхностные антигены клеточной стенки провоцируют типоспецифический
антительный ответ, а глубинные – видоспецифический [6,7].
При сальмонеллезе развитие и тяжесть симптомов обусловлены
интоксикацией и обезвоживанием. По мнению А.Ф. Билибина интоксикация –
явление сложное, сводящееся к изменению нервнорефлекторной деятельности и
гуморальной регуляции с обменными сдвигами. К.В. Бунин в основу синдрома
интоксикации ставит воздействие токсина на :
1) падение артериального давления, снижение сократительной способности
миокарда;
2) гормональную регуляцию водно-солевого обмена с изменениями биосинтеза
гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;
3) функцию почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение канальцевой
реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].
Сальмонеллезная интоксикация возникает как результат патологии
первичного ответа на инфекционный агент вследствие значительных потерь воды
и электролитов с рвотой и жидким стулом. По мере увеличения дефицита воды и
электролитов на первый план выступают симптомы обезвоживания и поражения
ЦНС. Если процесс прогрессирует, обезвоживание нарастает, появляются
признаки недостаточности кровообращения, которые при интоксикации имеют
клинику шока. Частая рвота и понос – первые признаки интоксикации [9].
Обязательным условием развития заболевания являются наличие большого
количества возбудителей и их токсинов, массовое проникновение антигенов в
кровь. Наибольшей токсичностью отличается липид А, вызывающий следующие
основные реакции: активацию лейкоцитов и макрофагов, стимуляцию выброса
эндогенного пирогена, антогониста глюкокортикоидов, интерферона,
интерлейкинов, подавление тканевого дыхания, активацию системы комплемента,
тромбоцитов, факторов свертывания крови другие [10,11], [рис. 1.1.1].
Главной причиной развития шока при сальмонеллезе считается не
повреждающее действие самих микробов или их токсинов, а своеобразный ответ
организма на них. Под токсико-инфекционным шоком следует понимать
экстремальное состояние организма, наступающее в результате действия
токсичных субстанций возбудителей, патогенных иммунных комплексов на органы
и ткани организма, сопровождающееся острым нарушением метаболизма в них
[12].
Схематическое изображение липополисахаридов
стенок микробов.
Рис. 1.1.1.
С.А. Степанов с помощью аспирационной биопсии обнаружил в тонкой
кишке больных сальмонеллезом изменение эпителия, острое воспаление
слизистой оболочки, нарушение микроциркуляции и сосудистой проницаемости.
К.Х. Ходжаев в эксперименте на крысах показал, что сальмонеллезная инфекция
вызывает нарушение процесов тканевого дыхания и фосфорилирования. Состояние
поджелудочной железы изучено Белянской Т.А. В острый период болезни
отмечено снижение ферментативной активности панкреатического сока – уровень
трипсина был снижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы – в 66 %.
Таким образом эндотоксин вызывает активацию синтеза, преимущественно
протеолитических ферментов, задержку экструзии секретируемых проэнзимов,
что приводит к секреции и поступлению ферментов в лимфатическое и
кровеносное русло [13,14].
При сальмонеллезе развивается обезвоживание, обусловленное потерей
внеклеточной жидкости, а при тяжелом течении заболевания и части клеточной.
Дегидратация в большинстве случаев имеет изотонический характер, сочетаясь
с развитием сгущения крови, дефицитом электролитов, метаболическим ацидозом
в капиллярной и венозной крови [15], [рис. 1.1.2].
2. Молекулярные механизмы развития эндогенной
интоксикации при сальмонеллезе
Явления интоксикации вызывают заболевания, сопровождающиеся
повышенным распадом тканей, усиленными процессами катаболизма,
недостаточностью функции печени и почек, снижением процессов
микроциркуляции [16].
В ответ на действие первичного патогена, которым являются
эндотоксины, сальмонелл, в организме развиваются типовые каскадные реакции,
что лежит в основе современной концепции СЭИ.
На Международном симпозиуме в Санкт-Петербурге (1994 г) было дано
определение этого синдрома как клинического синдрома с проявлением
симптомов интоксикации при патологических состояниях неоднородных по
этиологии и обуславливающих накопление в тканях и биологических жидкостях
организма продуктов патологического обмена веществ, метаболитов,
деструкции клеточных и тканевых структур, разрушения белковых молекул
[17,18].
Шано В.П. с соавторами подчеркивает, что токсическое влияние
липополисахаридной субстанции эндотоксина проявляется комплексом нарушений,
обусловленных повреждением как циркулирующих клеток в кровотоке, так и
эндотелиоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, следствием чего
является выброс в кровоток ряда биологически активных веществ – цитокинов,
интерлейкинов. Главной точкой приложения эндотоксина являются
эндотелиальные клетки, активация их приводит к высвобождению простациклина,
выделению эластазы, токсических метаболитов кислорода, факторов активации
тромбоцитов и комплемента с высвобождением терминального комплекса
комплемента, брадикинина с последующим формированием синдрома повышенной
проницаемости капилляров. Это приводит к тому, что в очаг воспаления
начинают входить компоненты крови, прежде всего фибриноген и тромбоциты.
Фибрин способствует агрегации тромбоцитов, полимеризации фибрина и –
возникновению тромбов. Следствием тромбоза являются нарушения
микроциркуляции с последующей гипоксией, что приводит к дальнейшим
повреждениям клеток в очаге воспаления. Метаболическим результатом этого
является изменение аэробного метаболизма клеток на анаэробный, повышенное
продуцирование лактата и протонов, снижение показателей рН [19].
Среди тканевых (клеточных) медиаторов воспаления важное место
занимают простагландины. Исходными продуктами для биосинтеза
простагландинов являются ненасыщенные жирные кислоты: линолевая,
арахидоновая, пентаноевая. Наибольшее значение имеет в организме
арахидоновая кислота, которая содержится в фосфолипидах клеточных мембран.
Простагландины вызывают сильное диуретическое и натрийуретическое
действие, оказывают разнообразное действие на желудочно-кишечный тракт. Они
могут стимулировать и тормозить сокращение и секреторную активность тонкой
кишки, тормозят секрецию соляной кислоты слизистой оболочки желудка.
Простагландины вызывают секрецию воды и электролитов в просвет кишки,
вызывая диарею, повышают концентрацию ц-АМФ в слизистой оболочке тонкой
кишки, влияют на прочность и упругость эритроцитарной мембраны [20, 21, 22,
49].
3. Показатели уровня эндогенной интоксикации
организма при сальмонеллезе
Анализируя данные литературы за последние десятилетия, можно сказать,
что основными показателями интоксикации при сальмонеллезе являются ПОЛ,
уровня холестерина, ЦИК, ИТ, МСМ и активность каталазы. При развитии
интоксикации на фоне сальмонеллеза происходит активный хемотаксис
нейтрофиллов в очаг воспаления, где они поглощая и переваривая чужеродный
агент, изменяют свою метаболическую активность, характеризующуюся
усилением поглощения кислорода, повышенной утилизацией глюкозы и
гиперпродукцией АФК ([pic]) [23, 24].
Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия
кислорода со многими органическими субстратами, в том числе с липидами.
Внедрение кислорода в молекулы окисленного субстрата приводит к образованию
реакционно-способных промежуточных продуктов – свободных радикалов,
гидроперекисей, которые в дальнейшем вызывают повреждение других классов
соединений – белков, нуклеиновых кислот, углеводов (рис. 1.3.1).
Метаболизм супероксидного радикала в норме
и при патологии (Владимиров Ю.Я., 1998)
Рис. 1.3.1.
Накопленные к настоящему времени данные литературы позволяют сделать
вывод о том, что свободнорадикальное окисление липидов при сальмонеллезной
инфекции играет определенную патогенетическую роль [25, 50].
Установлено, что при развитии ПОЛ в биомембранах понижается
содержание легкоокисляемых полиненасыщенных жирных кислот и изменяются
физико-химические свойства: микровязкость, текучесть, мембранный потенциал,
полярность внутренних областей мембран. Таким образом, изменяются
транспортные свойства мембраны и активность ферментов [26].
Регуляция свободнорадикального окисления обеспечивается в клетке
системой антиоксидантной защиты. Так, накапливающаяся в процессе ПОЛ
перекись водорода обезвреживается с помощью каталазы, присутствующей во
всех тканях организма. Каталаза (КФ 1.11.1.6.) представляет собой
гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250000 Д, локализованный
в пероксисомах клеток [27].
Митохондриальная каталаза участвует в оксидазном пути окисления,
сопровождающемся запасанием энергии в виде АТФ. Блокирование транспорта
электронов в дыхательной цепи приводит к стимуляции пероксисомального
окисления. При потологиях, связанных с нарушением энергетических процессов,
каталаза пероксисом может выходить из них и участвовать в окислении на
мембранах эндоплазматического ретикулума [28, 53].
В работе Л.Б. Оконенко с соавторами о состоянии антиоксидантной
системы судили по активности СОД, глутатионпероксидазы и каталазы, анализ
данных выявил дефицит антиоксидантов [29, 30].
При инфекционном токсикозе в мембранах эритроцитов резко снижается
содержание общих фосфолипидов, но увеличивается количество НЭЖК и
лизофосфотидилхолина, что косвенно указывает на повышение активности
фосфолилаз, которые избирательно разрушают липиды мембран. Холестерин
подвергается как активному, так и пассивному обмену в мембранах эритроцитов
[29]. Фермент лецитинхолестеролацил трансфераза превращает эфиры
холестерина в свободный холестерин и тем самым регулирует уровень
свободного холестерина в плазме, что способствует проникновению его в
мембраны. Следовательно, инактивация этого фермента в результате гипоксии
при эндотоксикозе ведет к повышению уровня эфиров холестерина в мембранах
эритроцитов [31,32].
Наряду с уровнем МДА, активности каталазы и уровня холестерина для
диагностики заболевания и его прогноза имеют значение и другие
неспецифические показатели – ЦИК, Ит, МСМ.
Синтезирующиеся при формировании иммунитета специфические антитела
обладают способностью взаимодействовать с антигенами возбудителей и тем
самым вызывать нейтрализацию патогенных микробов и их токсинов. Эта реакция
сопровождается образованием иммунных комплексов антиген – антитело [33, 34,
54, 55]. При патологических состояниях образование ИК выходит из под
контроля, в результате чего развивается та или иная болезнь ИК [рис.
1.3.2.].
Патогенетические механизмы болезней иммунных
комплексов (Сура В.В., 1987)
Рис. 1.3.2.
В результате развития эндотоксемии при сальмонеллезе организм
длительное время контактирует с избытком АГ как экзогенного (компоненты
микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных клеток самого
организма) происхождения. Вместе с тем наблюдается угнетение системы
комплемента, ответственного за лизис микробных клеток. В этих условиях
значительного избытка АГ и недостаточности выработки АТ может привести к
образованию ИК, которые способны откладываться в определенных тканях и
вызывать острые воспалительные реакции. При значительных отложениях
наблюдаются функциональные и морфологические повреждения органов и тканей
[35].
Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в окружающую
среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества
повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную
мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].
ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран,
вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки.
В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них
наибольший интерес представляют молекулы средней массы.
Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они
расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют
на ее уровень и прогноз [37, 38].
МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных
или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными
продуктами протеолиза. [39, 57].
Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой
биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют
гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых
кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию,
обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным
свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния
больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].
Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не
только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.
Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный
белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в
плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.
Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его
уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы.
Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их
структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА
обнаруживаются при патологии [41].
О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА,
которая снижается после того, как токсические вещества займут центры
связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных
свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки
зрения как диагностики, так и лечения [42].
2. Материалы и методы исследований
1. Материал исследований
Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных
эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового
диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и
активности каталазы.
Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных
сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа
51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.
Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве
не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов
сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-
20[pic]С.
2. Методы исследований
2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой
(Конюхова В.С., 1989)
Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного
продукта ПОЛ – малонового диальдегида.
Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА
реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с
максимумом поглощения при 535 им.
Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной
воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут,
охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при
6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля,
содержащего вместо плазмы воду.
Расчет: [pic] (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение
изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.
Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет
[pic]
концентрация МДА = [pic] (мкМоль/л).
2.2.2. Определение активности каталазы
(Королюк М.А., 1988)
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями
молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки
крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо
сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через
10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски
измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной
пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Расчет: [pic] (мкат/л), где
Е – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].
За единицу активности каталазы принимают то количество фермента,
которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при
заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
[pic]
[pic]
[pic] (мкат/л)
2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным
методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)
Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует
холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;
Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;
Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.
Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта
пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после
проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t =
37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и
инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при
500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно
холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной
температуре.
Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
[pic] ммоль/л, где
ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 %
ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры
растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива
№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл
раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт).
Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На
спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic]
при 450 нм.
Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности,
результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки.
Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в
100 мл сыворотки.
Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
[pic]
[pic]
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
[pic] усл. ед.
2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 %
раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции
света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В
качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный
дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет
0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000
об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл
дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете
при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254
нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах,
количественно равных показателям экстинции.
2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация
альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека
флуоресцентным методом
(Миллер Ю.И., 1994).
Принцип метода:
Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных
органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от
условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из
альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от
числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства
молекулы альбумина.
Состав набора:
Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора
используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт
ЭДТА.
Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является
специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции
которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного
альбумина.
Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с
сывороткой позволяет определить ОКА.
Определение показателя ЭКА:
К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2.
Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны
возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.
Определение показателя ОКА:
В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить
интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в
интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.
Подготовка образцов крови к измерениям:
Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл
дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в
пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут
жидкость 2,0 мл полученного образца.
Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.
3. Результаты исследования и их обсуждение
1. Определение показателей уровня интоксикации
в сыворотке крови практически здоровых людей
Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА, |
